广东重现性数字PCR方案

微流控芯片技术的发展为我们提供了一个实现低成本、小体积和高通量平行PCR分析的理想平台。2000年，Unger等采用多层软刻蚀 ( multilayer soft lithography，MSL) 技术在聚二甲基硅氧烷( polydimethylsiloxane，PDMS) 微流控芯片上设计并加工高密度微泵微阀结构(如图2b所示) ，他们将这种芯片称为IFC( integrated fluidic circuit)。IFC 利用PDMS材料具有高弹性的特点，通过多层软刻蚀技术在芯片上加工交织的液体和气体通道结构，可以快速并准确地将流体分成若干个**的单元，进行多步平行反应。2006 年Ottesen等将IFC芯片用于数字PCR分析，通过精细控制微泵微阀的开启和关闭，一步操作即可将一个样本平均分配到 1176个反应单元中，每个反应单元的体积只有6. 25 nl，成功代替了传统点样仪和384孔板。他们同时进行了6个样本7 056个单元的平行数字PCR分析。此外， Hansen及其同事采用 MSL技术加工了具有10^6个结构单元的数字PCR 芯片，每个反应单元的体积降低至10 pl，芯片密度达到 440000 /cm2。与微反应室数字PCR系统相比，IFC的特点是通量更高，每个反应单元的体积更小，加样更快。**近，Men等在2mm×2mm区域内加工了82000个 fl 级反应单元，进行数字PCR分析。常见的300种人、小鼠和大鼠基因表达Assay均已在QIAcuity数字PCR平台上经过验证。广东重现性数字PCR方案

*****的实时监控：已有数篇文章报道了使用数字PCR技术对患者***过程中的循环**DNA（ctDNA）进行检测，实时监控疾病进展。在非小细胞肺*、乳腺*和肠*等多种**患者中都取得了令人鼓舞的结果。与影像学及其他常规指标相比，ctDNA突变及丰度改变通常会提前数月出现，这样就可以提醒医生及时调整***方案，使患者得到更有效的***。无创产前筛查：唐氏综合征、地中海贫血或胎儿遗传性耳聋基因检测等，目前无创检测标本来源主要为孕妇血液，检测胎儿DNA会受到母体DNA的干扰，依靠数字PCR可提高检测准确性。对比NGS，数字PCR技术可以提高工作效率、降低检测成本。四川数字PCR数字PCR活动微反应单元体积越均一稳定、数量相对越多，定量的整体精度就越高。

甲基化分析：DNA甲基化是哺乳动物DNA的一种常见表观遗传修饰，它通过调节细胞中的基因表达从而在发育和疾病过程中发挥了重要的作用。异常的DNA甲基化涉及整个基因组的整体低甲基化和位于基因启动子区域和基因间DNA的CpG岛的局部超甲基化，这是人类恶性**中一个常见的表观遗传改变。基于PCR的方法已经被***的应用于DNA甲基化的评估，其原理是先采用亚硫酸氢盐来处理DNA，这会通过脱氨基作用将未甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶，然后设计与这些DNA进行特异结合的引物和探针进行扩增检测。然而，传统的PCR检测容易受到PCR抑制剂的影响，在非甲基化等位基因的背景下进行稀有甲基化等位基因检测的敏感性有限。而数字PCR是在无数个**的分隔之中进行反应，因此彼此之间较少受到抑制剂的影响，能够对传统方法检测不到的罕见甲基化等位基因进行精细的检测，未来有望将DNA甲基化作为一个具有区域性*变的预测指标或者**风险生物标志物来使用。

可以使用几种不同的方法来分配样品，包括微孔板，毛细管，油乳剂和带有核酸结合表面的小型化腔室阵列。样品的分配使人们可以通过假设分子种群遵循泊松分布来估计不同分子的数量，根据泊松分布的原理，反应体系中目标分子的拷贝数可以通过公式A=-ln[(N-X)/N]*N计算，从而解决了多个目标分子存在于单个液滴中的可能性。同时，从公式也可以看出，随着反应阳性体系数（X）的增加，体系中目标分子的拷贝数相对于X会有较大的差距，随着X的持续增加，数字PCR结果的不确定度也随着提高，总体来说，数字PCR阳性体系的数量不得超过总体系数量的80%。另一个方面，N的增加会使整个数字PCR体系具有较大的线性范围，并可以提高反应的灵敏度、稳定性以及可重复性。因此，目前dPCR都需要在成本可控的情况下，增加分配的腔室数和液滴数。微反应单元体积大小一致且稳定是泊松分布准确计算的前提。

拷贝数变异(CNV)研究：数字PCR直接读取阳性信号，通过泊松分布校正得到目标基因的***拷贝数，为拷贝数变异的研究提供了***的检测精度。采用数字PCR能够有效对二代测序（NGS）和微阵列比较基因组杂交（aCGH）等实验结果进行验证，并具有检测周期短、成本低、样本通量高等特点。低丰度DNA模板分子的精确定量：由于绝大部分微液滴中只含单个或不含模板分子，使得低丰度DNA模板分子的扩增不受高丰度模板分子扩增的竞争抑制：与此同时，样品中可能存在的抑制剂也在分配到微液滴的过程中进行了相对稀释，作用于单个微液滴内模板扩增的抑制剂数量大幅降低，从而提高PCR扩增对抑制剂的耐受程度，因此可应用于诸多临床样品（如血液、尿液、粪便、痰液、胸腹水、脑脊液等）中痕量核酸标记物的检测。一般而言，定量PCR的检测灵敏度约在1%，NGS的灵敏度可达到1%，而数字PCR的检测下限可轻松实现0.01%。可以用于白血病融合基因检测。云南数字PCR数字PCR

对干扰分子（背景信号、PCR抑制剂等）耐受度高，通过信号的“有”“无”定量而不是Ct值。广东重现性数字PCR方案

cdPCR主要以Fluidigm公司的BioMark HD系统以及Life Technology公司的QuantStudio 3D系统为**。Bio Mark系统采用微泵阀式芯片，以聚二甲基硅氧烷为芯片材料，主要依靠微流控通道与阀门的开闭进行原始体系分割，在芯片的反应仓进行PCR反应，然后通过类似于基因芯片的方法扫描每个通孔的荧光信号，进行目的序列含量的计算。QuantStudio 3D系统采用阵列微池式芯片，反应液由进样孔直接进入各微反应池。芯片式dPCR生成微滴体积均一，具有较高的稳定性，体系之间影响较小，但技术操作复杂，通量有限且实验成本较高。广东重现性数字PCR方案