湖北高灵敏度数字PCR共同合作

外周血MicroRNA的***定量：人体体液中稳定可检测的miRNA的发现为其作为疾病生物标志物提供了新的可能性，但是它们的含量可能极低，在体液中也缺乏已知的内源性参考基因，这为每一项可靠的转化应用都提出了真正的挑战。利用数字PCR的***定量优势，可以解决缺乏内源性参考基因的问题。有研究者证实，基于EvaGreen的ddPCR技术可以给出溶液之中miRNA分子的精确数量，并且在低丰度的miRNA定量中有更好的准确度，在四个数量级的浓度范围内都有很好的重复性，能够在低至1拷贝/μl的水平上检测到一个拷贝的miRNA，这种性能完全超过了传统定量PCR的表现。由于ddPCR能够提供更好的重复性，实验室内部和实验室之间的结果具有直接可比性，这使得ddPCR成为microRNA研究中非常有潜力的一个技术。可以用来检测外泌体micRNA。湖北高灵敏度数字PCR共同合作

数字PCR即Digital PCR（dPCR)，是一种核酸分子***定量技术。数字PCR是一种基于单分子快速PCR扩增，进行核酸拷贝数定量的一种方法。数字PCR( 也可称单分子PCR) 一般包括两部分内容，即PCR 扩增和荧光信号分析。在PCR 扩增阶段，与传统技术不同，数字PCR 一般需要将样品稀释到单分子水平，并平均分配到几十至几万个单元中进行反应。不同于qPCR对每个循环进行实时荧光测定的方法，数字PCR 技术是在扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行采集。***通过直接计数或泊松分布公式计算得到样品的原始浓度或含量。上海PCR数字PCR口碑推荐高精确度、高灵敏度，荧光定量qPCR灵敏度为1%-0.1%，数字化PCR灵敏度可达0.01-0.001%。

甲基化分析：DNA甲基化是哺乳动物DNA的一种常见表观遗传修饰，它通过调节细胞中的基因表达从而在发育和疾病过程中发挥了重要的作用。异常的DNA甲基化涉及整个基因组的整体低甲基化和位于基因启动子区域和基因间DNA的CpG岛的局部超甲基化，这是人类恶性**中一个常见的表观遗传改变。基于PCR的方法已经被***的应用于DNA甲基化的评估，其原理是先采用亚硫酸氢盐来处理DNA，这会通过脱氨基作用将未甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶，然后设计与这些DNA进行特异结合的引物和探针进行扩增检测。然而，传统的PCR检测容易受到PCR抑制剂的影响，在非甲基化等位基因的背景下进行稀有甲基化等位基因检测的敏感性有限。而数字PCR是在无数个**的分隔之中进行反应，因此彼此之间较少受到抑制剂的影响，能够对传统方法检测不到的罕见甲基化等位基因进行精细的检测，未来有望将DNA甲基化作为一个具有区域性*变的预测指标或者**风险生物标志物来使用。

数字PCR可以直接计算目标序列的拷贝数，因此无需依赖于对照样品和标准曲线就可以进行精确的***定量检测；此外，由于数字PCR在进行结果判读时*判断有/无两种扩增状态，因此也不需要检测荧光信号与设定阈值线的交点，完全不依赖于Ct值的鉴定，因此数字PCR的反应受扩增效率的影响**降低，对PCR反应抑制物的耐受能力**提高；数字PCR实验中标准反应体系分配的过程可以极大程度上降低与目标序列有竞争性作用的背景序列浓度，因此数字PCR技术也特别适合在复杂背景中检测稀有突变。制药公司巨头罗氏等也有数字PCR产品在研。

微流控芯片技术的发展为我们提供了一个实现低成本、小体积和高通量平行PCR分析的理想平台。2000年，Unger等采用多层软刻蚀 ( multilayer soft lithography，MSL) 技术在聚二甲基硅氧烷( polydimethylsiloxane，PDMS) 微流控芯片上设计并加工高密度微泵微阀结构(如图2b所示) ，他们将这种芯片称为IFC( integrated fluidic circuit)。IFC 利用PDMS材料具有高弹性的特点，通过多层软刻蚀技术在芯片上加工交织的液体和气体通道结构，可以快速并准确地将流体分成若干个**的单元，进行多步平行反应。2006 年Ottesen等将IFC芯片用于数字PCR分析，通过精细控制微泵微阀的开启和关闭，一步操作即可将一个样本平均分配到 1176个反应单元中，每个反应单元的体积只有6. 25 nl，成功代替了传统点样仪和384孔板。他们同时进行了6个样本7 056个单元的平行数字PCR分析。此外， Hansen及其同事采用 MSL技术加工了具有10^6个结构单元的数字PCR 芯片，每个反应单元的体积降低至10 pl，芯片密度达到 440000 /cm2。与微反应室数字PCR系统相比，IFC的特点是通量更高，每个反应单元的体积更小，加样更快。**近，Men等在2mm×2mm区域内加工了82000个 fl 级反应单元，进行数字PCR分析。DNA聚合酶对实验的准确性起着至关重要的作用。四川高灵敏度数字PCR服务

基于单分子快速PCR扩增，进行核酸拷贝数定量的一种方法。湖北高灵敏度数字PCR共同合作

数字PCR技术的原理非常简单，然而在样品分散（divide）的环节上却遇到了无法突破的瓶颈。早期的dPCR尝试使用96孔板到384孔板甚至1536孔板作为分散反应的载体，或者采用类似流式技术的磁珠乳液扩增方法(BEAMing-Beads, Emulsion, Amplification, Magnetics)，2006年 Fluidigm公司推出了***台商品化的基于芯片的商品化数字PCR系统。2008年德国 Inostics 推出基于磁珠法乳浊液扩增和流式检测方式的BEAMing dPCR 检测服务，但这些方法无论在分散程度和数据群体的体量上都无法达到更加精细的要求，时间和耗材成本严重限制了dPCR技术的发展。湖北高灵敏度数字PCR共同合作