山东荧光信号数字PCR欢迎咨询

微小残留病变（minimalresidualdisease，MRD）：随着化疗、靶向***、造血干细胞移植等***方式的改进，血液**的***效果日益改善。微小残留病（MRD）导致的复发是目前血液*****的一大难题。动态监测MRD对于评价***疗效、预测疾病复发、实施个体化***具有重要的指导意义。MRD检测方法需满足可定量、标准化、便捷性的要求。目前**常见的是流式细胞学（flowcytometry,FCM）和PCR两大类,但只有灵敏度高于10-4才能被纳入标准化评估。数字PCR技术，其有限稀释的特点可降低复杂的背景干扰，浓缩低丰度目的基因信号，从而提高MRD检测的灵敏度。在慢性髓系白血病中，Wang等同时用dPCR和qPCR检测了61名CML患者的外周血，这些患者在每3个月一次连续3次的qPCR检测中，已经检测不到BCR-ABL，dPCR检测到18%的患者是阳性的。在随后的随访中，dPCR能比qPCR提前几个月检测到BCR-ABL的升高。在淋系白血病的BCL2-IGHMBR检测中，Drandi等在222例样本中验证了dPCR和qPCR方法的一致性，还成功地将dPCR应用于3例qPCR无法检测的病例。数字PCR作为目前灵敏度和准确性比较高的分子检测方法，非常适用于微小残留病变评估。DNA聚合酶对实验的准确性起着至关重要的作用。山东荧光信号数字PCR欢迎咨询

肺*的ALK融合基因检测：ALK融合基因是NSCLC患者另外一个常规的伴随诊断，可以指导ALK-TKI药物的使用，目前已发现20种以上EML4-ALK的融合形式，多个报道证实它们中大部分能促进**生成。另外ALK还可能与TFG、KIF5B、KLC1、PTPN3、STRN等基因发生融合，因此ALK融合突变的诊断具有一定难度。目前临床常规使用的检测手段包括免疫组化（Immunohistochemistry，IHC），荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH）以及RT-PCR等三种。这三种方法各具优缺点：IHC相对简单，价格低廉，但是容易受到主观判断的影响；FISH可以检测各种融合类型，但是操作繁琐，价格昂贵；RT-PCR方法的特异性较好，结果客观，但是只能针对已知类型。近期有研究者采用数字PCR，利用ALK基因3’端的过表达来鉴定ALK的融合，该方法既具有PCR方法特异性好、结果客观的优势，同时又不受融合类型的限制，可以检测所有融合型，在与三种传统方法的对比过程中展现出了更好的临床符合率，未来有望成为一种新的常规检测手段。山东荧光信号数字PCR欢迎咨询通过直接计数或泊松分布公式计算得到样品的原始浓度或含量。

数字PCR (Digital PCR) 技术作为新一代核酸检测和***定量技术，目前在痕量核酸样本检测、复杂样本稀有突变检测和微小表达差异鉴定等方面表现出的优势已被普遍认可。NGS和CRISPR等分子生物学技术的发展，为数字PCR技术在microRNA研究、基因组拷贝数精细鉴定、致病微生物鉴定、转基因成分鉴定及基因细胞***等诸多领域带来了新的契机。良好的引物探针设计是数字PCR实验获得成功的关键因素之一。这正是众多研究人员选择LNA（锁核酸技术）的原因——LNA修饰的引物和探针采用了成熟可靠的算法设计，获得了全世界科学家的信赖。

1999年，Bert Vogelstein创造了“数字PCR”一词，文章正式报道于美国科学院院刊PNAS，并表明该技术可用于发现罕见的**突变。作者是美国**研究者、霍华德·休斯医学研究所研究员贝尔特·福格尔斯泰因（Bert Vogelstein）。目前dPCR主要有两种形式，芯片式和液滴式，但基本原理都是将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。良好的引物探针设计是数字PCR实验获得成功的关键因素之一。

从上世纪90年代以来qPCR技术的爆发式发展使得现代核酸检测技术具有全新的面貌，而进入二十一世纪之后，速度更快、通量更高。成本更低的DNA测序技术正在迅速发展，也是目前竞争**为激烈的研究领域之一，即使在这种情况下，dPCR技术仍然以其高度的灵敏性和特异性在诸多科学领域争取到属于自己的一席之地。即使在一些传统的qPCR应用领域，也有一些实验室同时选择dPCR平台进行平行实验以保证实验结果的准确和可重复性。在基因组变异研究领域，群体基因组水平上的SNP（Single Nucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性）检测面临的问题主要是突变序列往往与大量正常序列同时存在，竞争性反应严重影响突变序列的检测精度，数字PCR技术带来的极高的扩增特异性在稀有突变检测方面具有天然的优势，在**标志物检测、无创产前检查、线粒体突变检测等研究方向上，我们已经看到dPCR的许多精彩表现。通过锁核酸修饰的引物增强了对互补序列的亲和力和特异性，即使是微小表达差异也可以轻松检测。四川数字PCR欢迎咨询

在gDNA长度≥20kb或进行拷贝数变异检测实验时，必须对样品进行酶切处理。山东荧光信号数字PCR欢迎咨询

PCR扩增效率的高低直接影响**终信号的判读和实验结果分析。在进行热循环实验时，需检查样品的密封性以及PCR反应板是否和PCR仪热盖完全接触，确保PCR过程中样品反应液没有蒸发。QIAcuity数字PCR系统采用**的微反应腔室封闭方式，固态的物理分割和封闭可有效避免PCR过程中微反应体系的水分蒸发，确保微反应体系中样本反应液浓度的恒定，更易实现准确和精确的定量。原始数据中往往发现阳性信号与阴性背景之间存在许多弱阳性信号。因此需要对引物探针进行重新设计和优化（详见引物探针优化设计）或提升退火温度（探针通常比引物高5~10℃），以消除疑似荧光信号的“雨区“现象；此外，阳性信号和阴性背景间隙过小，导致**终结果无法准确判读。因此需要调整引物探针浓度（建议总反应体系引物浓度为600~800nM；探针浓度为200-400nM）或5' 端**个碱基如有G出现，则将其互补序列设计为实验所用探针，以提高阴阳性信号间隙，便于分析结果的准确判读。山东荧光信号数字PCR欢迎咨询