准确数字PCR活动

***代PCR技术是常规PCR技术，对目的基因扩增后进行凝胶电泳，将扩增条带与已知浓度的标准品比较，得到定性结果，但在产物分析时需要开盖操作，容易引起交叉污染，导致假阳性。第二代PCR技术是在PCR反应体系加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR反应进程，通过相关数据分析方法对目的基因进行定量分析的技术。数字PCR是第三代PCR技术，是一种采用微流控或微滴化的方法将稀释后的待测样品核酸溶液分散至微反应器或微滴中再在相同条件下进行单分子PCR，检测每一个微反应器或微滴中荧光信号通过直接计数或泊松分布修正得到原始浓度或含量的核酸分子***定量技术。目前大致可分为三类：微反应室/孔板数字PCR、大规模集成微流控芯片数字PCR、液滴数字PCR。通过直接计数或泊松分布公式计算得到样品的原始浓度或含量。准确数字PCR活动

肺*的ALK融合基因检测：ALK融合基因是NSCLC患者另外一个常规的伴随诊断，可以指导ALK-TKI药物的使用，目前已发现20种以上EML4-ALK的融合形式，多个报道证实它们中大部分能促进**生成。另外ALK还可能与TFG、KIF5B、KLC1、PTPN3、STRN等基因发生融合，因此ALK融合突变的诊断具有一定难度。目前临床常规使用的检测手段包括免疫组化（Immunohistochemistry，IHC），荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH）以及RT-PCR等三种。这三种方法各具优缺点：IHC相对简单，价格低廉，但是容易受到主观判断的影响；FISH可以检测各种融合类型，但是操作繁琐，价格昂贵；RT-PCR方法的特异性较好，结果客观，但是只能针对已知类型。近期有研究者采用数字PCR，利用ALK基因3’端的过表达来鉴定ALK的融合，该方法既具有PCR方法特异性好、结果客观的优势，同时又不受融合类型的限制，可以检测所有融合型，在与三种传统方法的对比过程中展现出了更好的临床符合率，未来有望成为一种新的常规检测手段。天津高灵敏度数字PCR对模板量要求高，过多会导致无法定量，过少会导致信号过低。

微流控芯片技术的发展为我们提供了一个实现低成本、小体积和高通量平行PCR分析的理想平台。2000年，Unger等采用多层软刻蚀 ( multilayer soft lithography，MSL) 技术在聚二甲基硅氧烷( polydimethylsiloxane，PDMS) 微流控芯片上设计并加工高密度微泵微阀结构(如图2b所示) ，他们将这种芯片称为IFC( integrated fluidic circuit)。IFC 利用PDMS材料具有高弹性的特点，通过多层软刻蚀技术在芯片上加工交织的液体和气体通道结构，可以快速并准确地将流体分成若干个**的单元，进行多步平行反应。2006 年Ottesen等将IFC芯片用于数字PCR分析，通过精细控制微泵微阀的开启和关闭，一步操作即可将一个样本平均分配到 1176个反应单元中，每个反应单元的体积只有6. 25 nl，成功代替了传统点样仪和384孔板。他们同时进行了6个样本7 056个单元的平行数字PCR分析。此外， Hansen及其同事采用 MSL技术加工了具有10^6个结构单元的数字PCR 芯片，每个反应单元的体积降低至10 pl，芯片密度达到 440000 /cm2。与微反应室数字PCR系统相比，IFC的特点是通量更高，每个反应单元的体积更小，加样更快。**近，Men等在2mm×2mm区域内加工了82000个 fl 级反应单元，进行数字PCR分析。

肺*的EGFR突变检测：EGFR突变目前已成为非小细胞肺*（Non-Small-Cell Lung Cancer，NSCLC）患者常规的伴随诊断，对于EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKI）的使用具有重要的指导作用。然而，由于多数NSCLC都处于晚期，很难取到足够的**组织完成该检测，不方便对患者的疗效和耐药情况进行动态监测。相反，血液、胸水以及脑脊液之类的体液标本中会含有**来源的DNA（Circulating tumor DNA，ctDNA），它们更容易获取，被认为是组织标本的有效替代品。由于体液标本中ctDNA的含量非常低，因此对检测方法提出了很高的要求。近年来，有研究者证实，数字PCR的检测敏感性可以低至0.04%，EGFR突变的血浆检测与组织学检测能够有很好的吻合性，相比于传统的检测方法，数字PCR可以***提高血浆中EGFR突变的检出率。此外，利用数字PCR***定量的优势，可以对血浆中EGFR突变的丰度进行动态监测，这种动态变化与患者使用TKI的疗效密切相关，可以更好的指导患者的***。随着越来越多循证医学证据的出现，NSCLC的血液EGFR突变检测正在成为ddPCR相当有前景的应用方向。对引物的特异性要求高。

微小残留病变（minimalresidualdisease，MRD）：随着化疗、靶向***、造血干细胞移植等***方式的改进，血液**的***效果日益改善。微小残留病（MRD）导致的复发是目前血液*****的一大难题。动态监测MRD对于评价***疗效、预测疾病复发、实施个体化***具有重要的指导意义。MRD检测方法需满足可定量、标准化、便捷性的要求。目前**常见的是流式细胞学（flowcytometry,FCM）和PCR两大类,但只有灵敏度高于10-4才能被纳入标准化评估。数字PCR技术，其有限稀释的特点可降低复杂的背景干扰，浓缩低丰度目的基因信号，从而提高MRD检测的灵敏度。在慢性髓系白血病中，Wang等同时用dPCR和qPCR检测了61名CML患者的外周血，这些患者在每3个月一次连续3次的qPCR检测中，已经检测不到BCR-ABL，dPCR检测到18%的患者是阳性的。在随后的随访中，dPCR能比qPCR提前几个月检测到BCR-ABL的升高。在淋系白血病的BCL2-IGHMBR检测中，Drandi等在222例样本中验证了dPCR和qPCR方法的一致性，还成功地将dPCR应用于3例qPCR无法检测的病例。数字PCR作为目前灵敏度和准确性比较高的分子检测方法，非常适用于微小残留病变评估。良好的引物探针设计是数字PCR实验获得成功的关键因素之一。江苏PCR数字PCR服务

高效筛查胎儿疾病，提高无创产检普及性和依从性。准确数字PCR活动

1999年，Bert Vogelstein创造了“数字PCR”一词，文章正式报道于美国科学院院刊PNAS，并表明该技术可用于发现罕见的**突变。作者是美国**研究者、霍华德·休斯医学研究所研究员贝尔特·福格尔斯泰因（Bert Vogelstein）。目前dPCR主要有两种形式，芯片式和液滴式，但基本原理都是将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。准确数字PCR活动